ISSN:
1433-0431
Keywords:
Schlüsselwörter Gelenkknorpelzellen • Hydrostatischer ¶Druck • Alginat • Sauerstoffpartialdruck •¶Redifferenzierung
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Key words Articular chondrocytes • Hydrostatic ¶pressure • Alginate • Oxygen partial-pressure • Redifferentiation
Source:
Springer Online Journal Archives 1860-2000
Topics:
Medicine
Description / Table of Contents:
Summary One of the goals in the field of tissue engineering is the development of artificial cartilage for the treatment of cartilage defects. Therefore autologous chondrocytes are seeded on different artificial matrices to test their possible use as implants (resorption, antigenicity, toxicity and their integration in the tissue). One of the main problems in these experiments is that usually the amount of available chondrocytes is too low for treating large-scale defects or for comparing different matrices. An in-vitro-multiplication of the cells is needed which causes the chondrocytes to dedifferentiate and become fibroblast-like. Therefore parameters which induce a redifferentiation are of great interest. The objective of this study was to determine the influence of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure on the redifferentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in monolayer and three-dimensional alginate bead culture. The redifferentiation process was monitored by immunocytochemical detection of newly synthesized collagen type II. The viability of the cells was determined by the trypanblue exclusion test. The chondrocytes were dedifferentiated by a two week culture in plastic flasks with an oxygen level of 20 %. After this they were subcultured in monolayer or three-dimensional alginate culture and subjected to three different stimuli for three weeks in order to redifferentiate: 1.) 20 % O2 (= 20,26 kPa Po2) + 5 % CO2 + 75 % N2; 2.) 5 % O2 (= 5,07 kPa Po2) + 5 % CO2 + 90 % N2; 3.) 5 % O2 (= 5,07 kPa Po2) + 5 % CO2 + 90 % N2 + 8 h/d of intermittent hydrostatic pressure (frequency: 3 bar absolute for 30 min and 1 bar absolute for 2 min). In the monolayer there was no detectable collagen type II found by immunocytochemistry under either of the three culture conditions. Therefore a redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes was not possible in monolayer cultures with the tested parameters. In the three-dimensional alginate culture there was no immunocytochemical staining of collagen type II found in the beads cultured with 20 % oxygen. With 5 % oxygen we found a strong collagen type II-production by chondrocytes throughout the whole bead. The intermittent hydrostatic pressure combined with 5 % oxygen lead to a decreased collagen type II-production compared to cells subjected to 5 % oxygen only. Also chondrocytes closer to the edge of these beads were more often immunopositive and seemed to produce more immunoreactive collagen type II. The viability of the chondrocytes in the alginate culture was close to 90 % after three weeks. Our experiments showed that oxygen partial pressure is an important parameter in the cultivation of articular chondrocytes. Reduced partial oxygen pressure promoted or induced the redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes in alginate culture.
Notes:
Zusammenfassung Im Bereich des sog. „tissue engineering“ wird derzeit an einem künstlichen Knorpelersatz gearbeitet, der zur Deckung von Defekten im Gelenkknorpel verwendet werden soll. Meist werden dabei verschiedene künstliche Matrices in vitro mit autologen Chondrozyten besiedelt und auf ihre Verwendbarkeit als Implantat (Resorbierbarkeit, Antigenität, Toxizität und Integration in bestehendes Gewebe) hin untersucht. Oft ist bei diesen Untersuchungen die zur Verfügung stehende autologe Knorpelzellmenge zu gering, um größere Defekte behandeln oder verschiedene Matrices miteinander vergleichen zu können. Daher ist eine In-vitro-Vermehrung der Chondrozyten notwendig, bei der die Zellen jedoch gleichzeitig dedifferenzieren und fibroblastenartig werden. Deshalb ist es von Interesse, Parameter zu untersuchen, die eine Redifferenzierung induzieren. Das Ziel dieser Untersuchung war es, den Einfluss von intermittierendem hydrostatischem Druck und niedrigem Sauerstoffpartialdruck auf die Redifferenzierung von Rindergelenkknorpelzellen im Monolayer und in dreidimensionaler (3-D-)Alginatkultur zu testen. Der Redifferenzierungsprozess wurde durch immunzytochemischen Nachweis von Typ-II-Kollagen überprüft. Die Vitalität der Zellen wurde mit Hilfe des Trypan-Blau-Ausschlusstests bestimmt. Die Chondrozyten wurden durch 2wöchige Kultur in Plastikflaschen bei 20 % O2 dedifferenziert. Danach wurden sie als Monolayer oder 3-D-Alginatkultur subkultiviert und für 3 Wochen 3 unterschiedlichen Stimuli zum Zwecke der Redifferenzierung ausgesetzt: 1.) 20 % O2 (= 20,26 kPa Po2) + 5 % CO2 + 75 % N2; 2.) 5 % O2 (= 5,07 kPa Po2) + 5 % CO2 + 90 % N2; 3.) 5 % O2 (= 5,07 kPa Po2) + 5 % CO2 + 90 % N2 + 8 h intermittierende hydrostatische Druckbelastung (Frequenz: 30 min Belastung bei 3 bar absolut und 2 min Entlastung bei 1 bar absolut) pro Tag. Im Monolayer konnte nach 3 Wochen für keine der 3 Kulturbedingungen immunzytochemisch neusynthetisiertes Typ-II-Kollagen nachgewiesen werden. Daher scheint eine Redifferenzierung der dedifferenzierten Chondrozyten im Monolayer unter den untersuchten Bedingungen nicht möglich zu sein. In der 3-D-Alginatkultur wurde bei den bei 20 % O2 gehaltenen Chondrozyten kein immunzytochemisch detektierbares Typ-II-Kollagen gefunden. Bei 5 % O2 war eine starke Typ-II-Produktion in der gesamten Kugel zu verzeichnen. Im Vergleich zu diesen zeigten Chondrozyten aus Kugeln, die zusätzlich noch mit intermittierendem hydrostatischem Druck behandelt wurden, eine geringere Typ-II-Kollagenproduktion (sowohl im Bezug auf die Menge der Immunfärbung als auch auf die Anzahl der Typ-II-produzierenden Zellen) und eine Häufung der positiven Zellen im Randbereich der Kugel. Die Vitalität der Zellen in den Alginatkugeln lag nach 3 Wochen bei ca. 90 %. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Sauerstoffpartialdruck ein wichtiger Parameter in der Kultivierung von Gelenkknorpelzellen darstellt. Ein reduzierter Sauerstoffpartialdruck förderte oder induzierte die Redifferenzierung von dedifferenzierten Chondrozyten in Alginatkultur.
Type of Medium:
Electronic Resource
URL:
http://dx.doi.org/10.1007/PL00003716
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