Gel diffusion—A simple and sensitive technique for the assay of proteinase inhibitors and its use for the determination of the ratio of proteinases in mixtures

Zusammenfassung

In caseinhaltigen Agarosegelen erzeugen sowohl Pepsin wie Chymosin radiale Diffusionszonen, deren Durchmesser bei gegebener Zeit dem Logarithmus der Enzymmenge proportional ist. Die Bestimmungsgrenze liegt für beide Enzyme unter 1 μg. Bei Zugabe des Inhibitors Pepstatin A zu den Proteinasepräparaten werden die Diffusionszonen beider Proteinasen verkleinert, aber in unterschiedlichem Ausmaße. Auf dieser Basis kann in technischen Labpräparaten das Mengenverhältnis Pepsin/Chymosin mit einer Genauigkeit von ±5% bestimmt werden. Bei Umkehr der Reaktion zum Nachweis des Inhibitors sind Mengen im Bereich von 10⁻⁹ Mol sicher erfaßbar. Die Methodik ist verallgemeinerungsfähig als Screening-Test für Proteinaseinhibitoren.

Summary

In casein-containing agarose gels, pepsin and chymosin form radial diffusion zones; the diameters of these zones show rectilinear correlations with the logarithm of the enzyme concentration at constant time. The sensitivity for both enzymes is below 1 μg. Addition of the inhibitor pepstatin A to these enzymes causes a reduction of the diameters of the diffusion zones, with large differences for both the enzymes. With this procedure, the pepsin/chymosin ratio in rennet preparations was assayed with an accuracy of ±5%. Identification of the inhibitors allows the determination of amounts in the namomole range. This method is a simple technique for the evaluation of proteinases and their inhibitors in screening systems.