In-vitro-Kontrakturtest und Gentypisierung in der Maligne Hyperthermie-Diagnostik

Zusammenfassung

Fragestellung: Die Maligne Hyperthermie (MH) wird bei genetisch prädisponierten Individuen und autosomal-dominantem Erbgang u.a. durch volatile Anästhetika und Succinylcholin ausgelöst. Der In-vitro-Kontrakturtest (IVKT) nach dem Protokoll der Europäischen-MH-Gruppe stellt aufgrund seiner hohen Sensitivität (97–99%) und Spezifität (93,6%) sowie der genetischen Variabilität der Erkrankung den „Goldstandard” der phänotypischen Diagnostik zur MH-Veranlagung dar. Andererseits besteht eine hohe Kopplung zwischen Mutationen am Ryanodinrezeptor-Gen (RYR1) und der MH-Disposition. Nachdem die C1840T-Mutation (Arg614Cys) am RYR1-Gen bei einem Individuum einer Großfamilie nachgewiesen werden konnte, war das Vorhandensein dieser Mutation in den übrigen Familienmitgliedern und die Übereinstimmung mit dem IVKT von Interesse.

Methodik: Von einer MH-Familie wurden 43 Angehörige nach dem Europäischen Protokoll des IVKT phänotypisch als MHS (MH-susceptible), MHN (-negativ) oder MHE (-equivocal) charakterisiert. Die genetische Untersuchung von 44 Familienmitgliedern hinsichtlich der Arg614Cys-Mutation erfolgte durch eine Restriktionsfragmentanalyse: Nach Isolierung der DNA aus Vollblut wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion ein 918 bp-Abschnitt des RYR1-Gens vervielfältigt und anschließend mit dem Restriktionsenzym RsaI zerschnitten. Beim Vorhandensein des C1840T-Basenaustauschs kann das Enzym an der Mutationsstelle der DNA nicht schneiden, es entstehen zum Normaltyp differente Bruchstücke.

Ergebnisse: Phänotypisch waren 25 Familienmitglieder MHS, 7 waren MHE und 11 MHN. Von 44 genetisch untersuchten Individuen hatten 23 die Arg614Cys-Mutation (52,3%), davon waren 19 nach dem IVKT MHS und ein Familienmitglied MHEc. Bei 9 MH-disponierten Individuen fehlte die Mutation, wobei 6 von ihnen MHE und 3 MHS waren. Bei 3 Individuen wurde die Mutation ohne vorherigen Kontrakturtest nachgewiesen, diese erhielten abgeleitet von den genetischen Befunden die Diagnose MHS.

Schlußfolgerungen: Beim Nachweis einer MH-assoziierten genetischen Veränderung kann diese unter Berücksichtigung von Ergebnissen des IVKT zur Diagnosestellung bzw. -sicherung herangezogen werden und MHE-Befunde präzisieren.

Abstract

Background: Malignant hyperthermia (MH) is an autosomal dominantly inherited disorder, triggered in susceptible individuals by inhalation anesthetics and depolarizing muscle relaxants such as succinylcholine. Because of its high sensitivity (97–99%) and specificity (93,6%) as well as the genetic heterogeneity of MH disorder, the in vitro contracture test (IVCT) following the European-MH-Group is considered to be the ”Gold Standard” for phenotypical determination of predisposed patients. On the other hand mutations in the skeletal muscle ryanodine receptor gene (RYR1) are tightly linked with MH susceptibility. After detecting a C1840T-mutation (Arg614Cys) in the RYR1 gene in one individual of a large MH family, we searched for this mutation in the remaining family members and determined the concordance with IVCT.

Methods: According to the European standard protocol for MH, 43 individuals of a large MH pedigree were assigned the status of MH susceptible (MHS), – negative (MHN) or – equivocal (MHE). The genetic investigation of 44 family members for the Arg614Cys-mutation was carried out by restriction fragment analysis: Genomic DNA was prepared from EDTA whole blood followed by amplification of a 918 bp RYR1 gene fragment by polymerase chain reaction. In presence of the Arg614Cys-mutation digestion with the restriction endonuclease RsaI would result in different DNA fragments of the amplified sequence than in absence of mutation.

Results: According to the response to IVCT, 25 individuals phenotypically revealed MHS, 7 MHE and 11 MHN status. Out of the 44 family members screened genetically for the Arg614Cys-mutation, the mutation was detected in 23 individuals. Out of them 19 were MHS and one was MHEc. The mutation was absent in 9 predisposed individuals, but six of them were MHE and three MHS. The mutation was also present in three individuals who had no MH screening (IVCT) before. For these last mentioned individuals the diagnosis MHS was deduced from genetic results.

Conclusion: Based on results of IVCT the identification of a MH associated mutation in a MH-family can make and support a correct MH diagnosis and can resolve MHE findings.