A fine structural study on the extracellular activity of alkaline phosphatase and its role in calcification

Abstract

Nine day old experimental calluses in radii of young rats were treated with Gomori's (1939) calcium-cobalt method to demonstrate ultrastructurally the presence of alkaline phosphatase in a search for its possible role in the desposition of calcium. Enzyme activity first appeared as globule-like precipitates outside the cell membrane of early hypertrophic cartilage cells. This precipitate layer then seemed to give rise to spherical bodies of alkaline phosphatase which occur at a slight distance from the cell. The spherical bodies were also observed further away from the cell in an intermediate zone between neighboring cells. Needle-like crystal formation, apparently calcification, occurred inside single or aggregated bodies, leaving their peripheral rim clearly visible, even when calcification had increased to such an extent that individual crystals could no longer be recognised. In controls, treated in the same way but without substrate, or with EDTA, no enzyme precipitate or spherical bodies were seen. The appearance of crystalline deposits in bodies which contain alkaline phosphatase seems difficult to explain on any other basis than that there is a close functional association between the enzyme and calcification.

Résumé

Des cals expérimentaux de neuf jours, formés au niveau de radius de jeunes rats, sont traités par la méthode calcium-cobalt de Gomori (1939) pour la mise en évidence ultrastructurale de la phosphatase alcaline afin d'étudier son rôle éventuel dans le dépôt du calcium. L'activité enzymatique apparait initialement sous forme de précipités globulaires en dehors de la membrane cellulaire de jeunes chondroblastes hypertrophiques. Ce précipité donne ensuite naissance à des corps sphériques de phosphatase alcaline qui se forme près de la cellule. Ces corps sphériques s'observent dans une zone intermédiaire plus éloignée. Une formation de cristaux en aiguilles (apparemment une calcification) se développe dans des corps isolés ou agrégés, laissant voir nettement leurs limites, même lorsque la calcification est plus avancée au point qu'on ne peut plus distinguer des cristaux individuels. Au niveau des coupes témoins, traitées de façon identique mais sans substrat ou avec de l'E.D.T.A., on n'observe ni précipité enzymatique ou corps sphériques. L'aspect des dépôts cristallins dans des corps qui contiennent de la phosphatase alcaline ne peut s'expliquer que par l'existence d'une association étroite entre enzymes et calcification.

Zusammenfassung

Neun Tage alter experimenteller Kallus an Radii von jungen Ratten wurde mit Gomori's (1939) Calcium-Kobalt Methode untersucht, um die Verteilung der alkalischen Phosphatase und ihre Beziehung zur Calciumablagerung ultrastrukturell zu demonstrieren. Enzymaktivität zeigte sich zuerst als globulares Präzipitat außerhalb der Zellmembran von Knorpelzellen im Beginn der Hypertrophie. Aus dieser Präzipitatschicht entstanden dann gerundete Körperchen, die sich von der Zelle abtrennten. Solche Körperchen wurden auch in größerer Entfernung von der Zelle beobachtet, d.h. in einer Zwischenzone zwischen benachbarten Zellen. Nadelförmige Kristalle, wahrscheinlich von Calcium-Salzen, wurden in einzelnen oder aggregierten Körperchen beobachtet. Die äußere Zone der Körperchen blieb jedoch deutlich sichtbar, selbst dann, wenn der Calciumgehalt derart zugenommen hatte, daß einzelne Kristalle nicht länger erkennbar waren. In Kontrollen, die in gleicher Weise behandelt waren, aber ohne Substrat oder mit Zufügung von EDTA, wurden weder Präzipitate noch Körperchen beobachtet. Das Auftreten von Calciumablagerungen in alkalischer Phosphatase enthaltenden Körperchen scheint kaum anders erklärbar als durch eine enge funktionelle Verbindung zwischen Enzym und Calciumablagerung.