Ultramicroanalysis of pH,$P_{CO_2 }$ and carbonic anhydrase activity at calcifying sites in cartilage

Abstract

The mechanism by which (HCO ⁻₃ ) is elevated in extracellular cartilage fluids (C_fl) of rat tibial growth plates was investigated. Inin vitro studies, the pH-$P_{CO_2 }$ curves in a synthetic lymph were not detectably altered by proteinpolysaccharides or by a cationic protein. Also, (HCO ⁻₃ ) in C_fl aspirated from isolated incubates of growth cartilage decreased rapidly as a function of time. Results of both of these experiments mitigated against a role for cartilage secretions as the cause of blood-C_fl (HCO ⁻₃ ) gradientsin vivo. Acetazolamide administered to ratsin vivo reduced the blood-C_fl (HCO ⁻₃ ) gradient to an undetectable level. This effect could not be attributed to systemic acidosis produced by acetazolamide since control rats with a similar degree of systemic acidosis resulting from NH₄Cl treatment, maintained a substantial blood-C_fl (HCO ⁻₃ ) gradient. The distribution of carbonic anhydrase activity in epiphyseal and metaphyseal tissues of similar rats was determined by microassay. Enzymatic activity was not detected in cartilage samples, but was found in significant amounts in adjacent structures.

This carbonic anhydrase activity measured in adjacent structures was hypothesized to represent sites of HCO ⁻₃ secretion. The possible involvement in HCO ⁻₃ secretion of epiphyseal or metaphyseal capillaries and bone cells is discussed.

Résumé

Le mécanisme de l'élévation du (HCO ⁻₃ ) dans les liquides extracellulaires du cartilage (C_fl) a été étudié au niveau, de métaphyses tibiales de Rat. Au cours d'étudesin vitro, les courbes pH-$P_{CO_2 }$ dans une lymphe synthétique ne sont pas modifiées de façon nette par des protéines-polysaccharides ou par une protéine cationique. (HCO ⁻₃ ) de C_fl, aspiré à partir de pièces métaphysaires, incubées isolément, décroit rapidement en fonction du temps. Les résultats de ces deux expériences semblent infirmer un rôle des sécrétions cartilagineuses comme cause de gradients sang— C_fl (HCO ⁻₃ ) in vivo. L'acétazolamide, administré à des ratsin vivo, réduit le gradient sang —C_fl (HCO ⁻₃ ) jusqu'à, un seuil non dosable. Cette action ne peut être attribuée à l'acidose généralisée, produite par l'acétazolamide, étant donné que les rats témoins, ayant une acidose généralisée similaire, provoquée par un traitement à NH₄Cl, présentent un gradient sang —C_fl (HCO ⁻₃ ) net. La répartition de l'activité en anhydrase carbonique dans les tissus épiphysaires et métaphysaires de rats identiques est déterminée par micro-analyse. L'activité enzymatique n'est pas détectée dans des échantillons cartilagineux, mais est retrouvée, de façon significative, dans les structures adjacentes.

L'activité en anhydrase carbonique, mesurée dans les structures adjacentes, est considérée comme les lieux de sécrétion d'HCO ⁻₃ . Le rôle éventuel des capillaires épiphysaires et métaphysaires et des cellules osseuses dans la sécrétion d'HCO ⁻₃ , est envisagé.

Zusammenfassung

Der mechanismus, durch welchen (HCO ⁻₃ ) in extrazellulären Knorpelflüssigkeiten (_fl) der Wachstumsplatten von Rattentibiae erhöht ist, wurde untersucht. Beiin vitro Versuchen mit einer synthetischen Lymphe waren die pH-$P_{CO_2 }$ Kurven weder durch Proteinpolysaccharide noch durch kationisches Protein nachweisbar verändert. In C_fl, welche aus isolierten Inkubaten von Wachstumsknorpel entnommen wurden, nahm (HCO ⁻₃ ) in Funktion der Zeit ebenfalls rasch ab. Die Resultate beider Experimente sprechen dagegen, daß die Knorpelsekretein vivo als Ursache der Blut-C_fl (HCO ⁻₃ )- Gradienten in Betracht kommen. Acetazolamid, das Ratten verabreicht wurde, erniedrigte den Blut-C_fl (HCO ⁻₃ )-Gradienten auf ein nicht mehr nachweisbares Niveau. Dieser Effekt konnte nicht einer durch Acetazolamid hervorgerufenen generalisierten Acidose zugeschrieben, werden, da Kontrollratten mit einem ähnlichen Grad von generalisierter Acidose, welche von einer NH₄Cl-Behandlung herrührte, einen ansehnlichen Blut-C_fl (HCO ⁻₃ )-Gradienten aufrechterhielten. Die Verteilung der Kohlensäureanhydrase-Aktivität in epiphysären und metaphysären Geweben von gleichartigen Ratten wurde durch Mikroanalyse bestimmt. Eine enzymatische Aktivität konnte in den Knorpelproben nicht nachgewiesen werden, wurde jedoch in signifikanten Mengen in den angrenzenden Geweben gefunden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die Stellen, wo diese Kohlensäureanhydrase-Aktivität in angrenzenden Geweben gemessen wurde, den Sekretionsstellen von HCO ⁻₃ entspricht. Die mögliche Beteiligung von epiphysären und metaphysären Capillargefäßen und von Knochenzellen an, der HCO ⁻₃ -Sekretion wird diskutiert.