Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase in Experimental Viral Myocarditis

Abstract

Nitric oxide (NO) is an important bioactive molecule with regulatory, cytotoxic or cytoprotective properties. In virus-induced myocarditis, NO mediates host defense mechanisms against the infection or causes cardiac dysfunctions. NO is synthesized from L-arginine by the enzyme nitric oxide synthase (NOS). The expression of the inducible form of the nitric oxide synthase (iNOS) is regulated by cytokines, involved in the complex myocardial immune response to enterovirus infections.

The present study was undertaken to characterize the role of iNOS and NO in the murine model of viral myocarditis induces by coxsackievirus Be (CVB3). In response to CVB3 infection we investigated the time course of iNOS induction in correlation with cytokine mRNA expression (TNF-α, IL-1α, IFN-γ, TGF-β) in the heart of NMRI mice by RT-PCR.

Positive PCR signals for viral RNA were found in the acute and chronic stage of disease by seminested PCR, indicating the persistence of viral genome. We found distinct expression of iNOS at all time points (1, 2, 3, 4, 7, 14, 28, 56, 98 days post infection [p. i.]. Higher iNOS mRNA levels were identified between days 4 until 28 p. i. in comparison to day 56 and 98 p. i. using densitometric values. The mRNA of the inflammatory cytokines TNF-α, IL-1α, IFN-γ appeared at days 1, 4, and 7 p. i., peaked at day 7 p. i. and persisted until day 98 p. i. Similar like the iNOS mRNA pattern was the expression profile of TGF-β. Using in situ hybridization and immunohistochemistry iNOS was localized in infiltrates, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, myocytes and throughout the interstitial spaces between myocardial fibers in the heart sections of NMRI mice. Increased levels of NO were measured as total nitrate/nitrite concentration in the sera of mice from day 7 until day 28 p. i.

Zusammenfassung

Stickoxid (NO) ist ein wichtiges bioaktives Molekül mit regulatorischen, zytotoxischen oder zytoprotektiven Eigenschaften. Bei der viralen Myokarditis vermittelt NO einerseits Wirtsabwehr gegen die virale Infektion, andererseits jedoch kardiale Dysfunktion. Stickoxid wird synthetisiert aus L-Arginin durch das Enzym Stickoxidsynthase (NOS). Die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) wird durch Zytokine reguliert, die in die komplexe Immunantwort des Myokards auf Enterovirusinfektionen involviert sind.

Die vorgestellten Untersuchungen charakterisieren die Rolle von iNOS und NO in einem murinen Modell der viralen Myokarditis, induziert durch Coxsackie-Virus B3. Wir untersuchten den zeitlichen Verlauf der iNOS-Induktion in Korrelation zur Zytokin-mRNA-Expression von TNF-α, IL-1α, IFN-γ und TGF-β im Myokard von NMRI-Mäusen nach CVB3-Infektion mittels RT-PCR.

Virale RNA konnte in der akuten und chronischen Phase der Erkrankung mit der seminested PCR nachgewiesen werden, was die Persistenz des viralen Genoms belegt. Wir fanden eine deutliche Expression von iNOS zu allen untersuchten Zeitpunkten (ein, zwei, drei, vier, sieben, 14, 28, 56, 98 Tage post infectionem [p. i.]). Basierend auf einer densitometrischen Auswertung waren erhöhte iNOS-Spiegel am siebten, 14. Und 28. Nach Infektion nachweisbar im Vergleich zu den Tagen 56 und 98 p. i. Die mRNA-Expression der inflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1α, IFN-γ war am ersten, vierten bzw. siebten Tag p. i. nachweisbar, erreichten am siebten Tag p. i. ihr Maximum und persistierte bis zum 98. Tag p. i. Ähnlich wie die iNOS-mRNA-Expressionsmuster waren die von TGF-β. Mittels In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie konnte iNOS in Infiltraten, Gefäßendothel- und glatten Muskelzellen, in Myozyten und im Interstitium des Myokards lokalisiert werden. Erhöhte Werte von NO, bestimmt als Gesamtnitrat/-nitritkonzentration, wurden an den Tagen 7, 14 und 28 p. i. gemessen.