Methode rapide de preparation de DNA transformant tres purifie

https://doi.org/10.1016/0005-2787(70)90041-9Get rights and content

Abstract

A rapid method for the preparation of highly purified transforming DNA

A rapid procedure for the preparation of highly purified transforming Hemophilus influenzae DNA is described. It needs only one column chromatography of the crude cell extract (suspended in NaCl 0.3 M–0.05 M phosphate buffer) on silicic acid 100 mesh to remove 80–85 % of the total proteins of the extract by retention on the column.

The adsorption capacity of the column is 2.5 mg of proteins per 1 g of silicic acid.

The effluent of the column contains the DNA in the form of DNA-RNA mixture. The effluent fractions showing a high optical absorption at 260 mμ are collected and therefrom the DNA-RNA mixture is precipitated by ethanol.

A further treatment with ribonuclease followed by isopropanol precipitation, leads to a highly purified transforming DNA preparation with at the most 3 % residual proteins and with practically no RNA contamination.

Résumé

Le passage d'un lysat cellulaire sur colonne d'acide silicique retient plus des trois quarts des protéines et laisse passer le complexe DNA-RNA. Un traitement ultérieur à la ribonucléase, suivi d'un Sevag, d'une précipitation à l'alcool isopropylique et d'un lavage à l'alcool éthylique permet de se débarrasser de la quasi totalité du RNA et des protéines restantes, tandis que le pouvoir transformant et la masse moléculaire du DNA ne subissent aucune altération notable.

La méthode utilisée permet donc d'obtenir du DNA transformant trés pur dans un temps relativement court et avec un minimum de manipulations.

Notre méthode est sensiblement plus rapide et plus quantitative que l'extraction du DNA au phénol qui nécessite une digestion préalable à la pronase, pendant 7 h, et sans laquelle on aboutit à une perte de 95% de DNA7. La présence de phénol, même en quantités minimes, empêche l'évaluation correcte des quantités de DNA à 260 mμ, d'où nécessité d'une dialyse très poussée.

Notre méthode aboutit également à une meilleure déprotéinisation du DNA. En effet, Berns et Thomas7, par méthode à la pronase et extraction au phénol arrivent à un DNA contenant 9 mg de protéines pour 100 mg de DNA, alors que les DNA que nous obtenons ont au maximum 3 mg de protéines pour 100 mg de DNA.

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